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定量SDS凝胶染色与扫描

2024-02-12 作者: 星座娱乐平台

详情介绍

  1) 小心肠在 SDS 凝胶泳道上加一组按量递增为序的蛋白质样品,再按相同次序加一组纯蛋白质样品作为定量的规范。按惯例进行电泳(见附录 5)。

  2) 从电泳装置取下凝胶,置于脱色液中漂洗 1 min 以脱去部分 SDS,再将它浸泡在 CBB 染色液中,于 20°C 缓慢摇摆(如在脱色摇床上)。0.75-mm 厚的凝胶需浸泡 lh,1.5-mm 厚的凝胶约需 4 h。

  3) 倾出 CBB 染色液,将凝胶浸泡在脱色液中,缓慢摇摆1~4 h, 视凝胶厚度而定 (用海绵或 Kimwipe 纸巾吸收游离的染料)。当大部分染料由凝胶扩散出来后, 从容器中取出吸收物,于脱色液中参加 CBB 染色液,使其 A650nm值达 0.1(浅蓝色)。其时,CBB 的浓度大于它与蛋白质的均匀结合系数。凝胶置于此稀染色液中平衡过夜,并保存于其间直至扫描测定。

  4) 在 650nm 波长下,扫描经染色和脱色的凝胶,测定各蛋白带中结合染料的量。

  5) 对每条带,以结合染料量对其加样量作图,比较所得直线与规范曲线的斜率, 核算各样品中意图蛋白的浓度。

  6) 对原材料或纯化各步祥品的凝胶扫描全程进行积分,核算σ32带中的蛋白质占总蛋白量的份额。

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